支原體檢測

支原體檢測技術概述

簡介

支原體（Mycoplasma）是一類無細胞壁、能夠自我復制的最小原核微生物，廣泛存在于自然界及動植物體內。由于其體積微小（直徑通常為0.2~0.3 μm）且缺乏細胞壁，支原體難以通過常規過濾或抗生素（如青霉素）清除，易污染生物制品、細胞培養體系，并引發人類和動物感染性疾病。例如，肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae）是社區獲得性肺炎的重要病原體，而生殖支原體（Mycoplasma genitalium）則與泌尿生殖系統感染相關。因此，支原體檢測在臨床診斷、生物制藥質量控制、細胞培養安全等領域具有重要意義。

支原體檢測的適用范圍

支原體檢測技術主要應用于以下場景：

1. 生物制藥與細胞治療：確保細胞培養基、疫苗、單克隆抗體等生物制品無支原體污染。
2. 臨床診斷：針對呼吸道感染、泌尿生殖系統感染等疾病的病原學診斷。
3. 動物疫病防控：檢測畜禽支原體感染（如豬肺炎支原體、雞毒支原體），保障畜牧業健康。
4. 科研實驗質控：避免細胞培養體系因支原體污染導致實驗數據偏差。

檢測項目及簡介

支原體檢測的核心項目包括以下幾類：

1. 培養法檢測 通過將樣本接種于專用液體或固體培養基（如SP-4培養基），觀察支原體的生長情況。該方法特異性高，但耗時較長（需2~4周），且部分支原體難以體外培養。

2. PCR檢測（聚合酶鏈式反應） 針對支原體特異性基因（如16S rRNA基因、gap基因）設計引物，通過核酸擴增技術快速檢測樣本中的支原體DNA。具有靈敏度高（可檢測至10 copies/μL）、耗時短（4~6小時）的優點，但需嚴格防止交叉污染。

3. 熒光定量PCR（qPCR） 在常規PCR基礎上引入熒光探針，可實時監測擴增過程并定量分析支原體載量，適用于動態監測感染進程或污染程度。

4. 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 檢測血清中支原體特異性抗體（如IgM、IgG），用于臨床感染篩查。其操作簡便，但窗口期可能漏檢早期感染。

5. DNA熒光染色法 利用Hoechst 33258等熒光染料標記支原體DNA，通過顯微鏡觀察細胞培養物中的支原體污染。該方法快速直觀，但靈敏度較低，需結合其他方法驗證。

檢測參考標準

支原體檢測需遵循國內外權威標準以確保結果可靠性，主要包括：

1. 中國藥典（2020版）通則3301 《生物制品支原體檢查法》，規定生物制品中支原體污染的培養法和指示細胞培養法。

2. USP <63> Mycoplasma Tests，美國藥典中關于細胞培養物及生物制品支原體檢測的標準流程。

3. ISO 17025:2017 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories，規范實驗室質量管理體系。

4. EP 2.6.7 European Pharmacopoeia 中關于支原體檢測的指南，強調PCR方法的驗證要求。

檢測方法及儀器

1. 培養法

   • 儀器：恒溫培養箱、厭氧培養系統、倒置顯微鏡。
   • 流程：樣本接種后于37℃、5% CO?條件下培養，定期觀察培養基渾濁度變化，并通過亞甲藍染色或瓊脂平板菌落形態確認。

2. PCR/qPCR

   • 儀器：PCR擴增儀（如Bio-Rad T100）、實時熒光定量PCR儀（如ABI 7500）。
   • 試劑：支原體特異性引物/探針、Taq酶、dNTPs。
   • 流程：提取樣本DNA→配制反應體系→擴增→分析熔解曲線或Ct值。

3. ELISA

   • 儀器：酶標儀（如Thermo Multiskan FC）、洗板機。
   • 試劑：包被支原體抗原的微孔板、酶標二抗、顯色底物。
   • 流程：血清樣本孵育→洗滌→加酶標抗體→顯色→測定OD值。

4. DNA熒光染色法

   • 儀器：熒光顯微鏡、細胞培養箱。
   • 試劑：Hoechst 33258染液、固定劑（甲醇/冰醋酸）。
   • 流程：固定細胞→染色→鏡檢，支原體DNA呈現藍色熒光顆粒。

技術挑戰與發展趨勢

當前支原體檢測仍面臨部分挑戰：培養法周期長、PCR法假陽性風險、ELISA抗體交叉反應等。未來發展方向包括：

1. 多重PCR技術：同時檢測多種支原體，提升效率。
2. 微流控芯片：整合核酸提取、擴增與檢測，實現便攜化。
3. 宏基因組測序（mNGS）：用于未知支原體物種的鑒定。

結語

支原體檢測技術的精準性和效率直接影響疾病診療、生物制品安全及科研數據可靠性。隨著分子生物學技術的進步，檢測方法正朝著高通量、自動化的方向發展。實驗室應根據具體需求選擇適宜方法，并嚴格遵循標準化流程，以確保檢測結果的科學性與可重復性。